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连接酶最新娱乐体验_-抗胰蛋白酶(2024年12月深度解析)

内容来源：鱼水欢网络所属栏目：话题更新日期：2024-12-01

连接酶

载体构建攻略𐟔犰Ÿ”젨𝽤𝓦ž„建全流程目的基因的扩增首先，从NCBI上找到目的基因的核苷酸序列，利用Snapgene设计引物。通常在序列的前后各选20-25bp作为上下游引物。先用普通MIX进行退火温度优化，然后使用高保真酶（如诺维赞的2X Phanta⮠Max Master Mix）进行50uL体系的扩增。若需要高浓度，可扩增两管。连接连接目的基因与载体可选择T4连接酶，需在目的基因两端设计酶切位点和保护碱基（注意这些位点不能出现在片段内，以免片段被内部切开）。也可选择无缝克隆方式，利用同源重组原理，在引物5'端加入载体的同源臂，引物顺序为同源臂+酶切位点+基因引物。我个人偏爱这种方式，省时方便。本次使用的是诺维赞的ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit连接酶，9个片段一次性连接成功。20uL的连接体系在37℃作用30 min，取10 uL用于转化。目的基因与载体的比例本次使用的载体是PcDNA3.1(5500bp)，基本50ng的载体就足够了。ClonExpress⮠II One Step Cloning Kit试剂盒推荐的载体和片段的摩尔比为1：2，例如片段500bp，浓度5ng/uL，载体5000bp，浓度25ng/uL。则片段摩尔数是载体的2倍，片段需要2㗵=10ng，即2uL。转化取10 uL连接产物转化DH5a。阳性克隆的筛选在1.5mL的EP管中加入800 uL的氨苄LB，用10uL的枪头把单个菌落全部占走，打入EP管中，震荡培养4h。一般选择8个克隆。4h后进行菌液PCR鉴定阳性克隆，选择2个送测序。注意事项移码问题：选择酶切位点时注意是否会引起目的基因的移码，可用Snapgene模拟。感受态：购买的商品化感受态可一支当两用，否则太浓不好挑选。自制的感受态在使用前需设置阳性对照，排除感受态质量问题。终止密码子和起始密码子：用于蛋白表达的目的基因需从ATG开始，以终止密码子结尾。 𐟔砦ž„建小贴士退火温度优化：对于高保真酶，退火温度至关重要，可通过梯度PCR找到最佳温度。引物设计：选择合适的引物长度和位置，确保扩增效率和特异性。连接效率：优化连接体系，确保目的基因与载体的高效连接。筛选策略：通过多个克隆的筛选，提高阳性克隆的比例。通过以上步骤，你可以顺利构建出含有目的基因的载体，为后续实验打下坚实基础。

30-双酶切的关键步骤，你掌握了吗？ 𐟕’ 双酶切的时间和体系：双酶切一般需要3个小时，但也可以使用大体系，例如100微升。 𐟒砧𚯥Œ–方法：推荐使用柱式纯化方法，割胶可能会有些麻烦。 𐟌🠩…𖩇问题：以TAKARA的酶为例，1单位酶的定义是：在50 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 的NA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。该酶浓度约为15单位/微升，可以分解15的DNA。而一般从1-4ml菌液提取的DNA约为3，PCR纯化后的产物（50体系）也约为3。因此，即使全部加进去，只要纯化质量好，酶切完全没问题。 𐟔— 连接反应：连接酶说明写的是过夜，但对连接酶单位的定义为：在20 的连接反应体系中，6 的NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/，所以完全够用。连接酶易失活，最好在冰上操作。3个小时足够。 𐟓 重要的几点：做转化连接反应时，注意保持低温状态，一般连接3小时，16度。对含有AMP的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高会使克隆株无法筛选出来。验证双酶切是否成功的方法：酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性。如两管均成线性可初步判断双酶切成功。做转化时，也要进行对照。设4个对照：拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功。如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切；如没长出克隆，则证明双酶切成功（当然要保证感受态、培基、连接酶都正常）。酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化。这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。 AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。 𐟧Š 试剂保存：所有的试剂切记低温保存。一步一个脚印，不要偷懒，图省事最后却更费事。注意设立对照。 𐟔젩‰𔥮š：经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，挑选3-4个就足够了。然后进行双酶切鉴定和测序。

手把手教你构建质粒载体嘿，大家好！今天我们来聊聊如何用质粒构建技术来搞定你的科研项目。作为一个科研小白，这个过程可能会让你有点头大，但别担心，我来帮你理清楚！第一步：双酶切 𐟔ꊩ斥…ˆ，你需要选择合适的酶切位点。这一步是整个过程的起点。常见的酶切体系是这样的：内切酶1：1 内切酶2：1 酶缓冲液：5（根据浓度）载体：2 ddH₂O：补齐到50 37℃酶切1小时。记得在酶切前算好量，先加ddH₂O，最后加内切酶。第二步：切胶回收 𐟧슩…𖥈‡完成后，你需要跑琼脂糖胶来鉴定酶切效果。配胶时注意选择合适的胶浓度，分子量越大，胶浓度越小。跑胶完成后，紫外灯下一般会有两段，分别是载体和切下来的片段。根据结果进行胶回收，注意切下来的片段不回收。胶回收完成后测浓度备用。第三步：连接 𐟔— 插入片段可以根据自己的实验选择，通常可以通过PCR获得，或者是由三方公司合成的序列。在连接开始前，也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见连接体系如下：酶切后的载体：25ng 插入片段：1 T4 ligase buffer：1 T4连接酶：1（根据浓度） ddH₂O：补齐至10 16℃连接4小时以上或过夜。记得加入载体和插入片段的量由说明书得来，加样前计算好量，先加ddH₂O，最后加连接酶。小tips：为确保连接的顺利进行，务必保证连接酶和连接酶缓冲液配套使用，不能混用。第四步：转化 𐟦 进行转化时，根据载体说明书选择合适的感受态细胞，常用DH5€‚同时仔细阅读感受态细胞说明书，看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。第五步：挑取单克隆 𐟧𘊦졦—妗餸Š，挑取单克隆，推荐至少选择两个及以上。第六步：摇菌 𐟍𚊦‘‡菌时，注意拧松菌管的盖子或者使用封口膜，倾斜放入恒温（一般为37℃）摇床，摇菌时间8小时为宜。第七步：提质粒送测序 𐟧슦‘‡菌完成后进行质粒提取，测浓度后送测序。注意这里会有部分说明书推荐选择新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定，这也是一种鉴定方式，可以根据酶切片段的大小来判断重组是否正确，但是最终确定还是推荐进行测序。第八步：保菌 𐟧Š 对测序正确的菌株进行保菌，并提质粒进行后续实验。小贴士 𐟒ከ𔨧𒒦ž„建方法多种多样，小伙伴们也可以选择同源重组的方法进行哦！希望这些步骤能帮到你，祝你的科研之路顺利！

基因克隆的那些事儿 𐟧슥Ÿ𚥛 克隆的过程，听起来很酷炫，但实际操作起来却有不少坑。今天咱们就来聊聊那些让人头疼的小细节。聚合酶的那些事儿 𐟤” 首先，咱们得说说 DNA 聚合酶。这玩意儿在 PCR 过程中可是个大功臣，但也有不少麻烦。首先，Taq/DNA 混合物的解离常数在室温下是 20 nM，跟扩增产物的终浓度差不多，所以酶和扩增产物经常一起被纯化出来。这样一来，残存的聚合酶就会阻止限制性内切酶作用于 DNA 末端，或者填补突出的部分，搞得你一头雾水。更糟糕的是，市面上一些改造后的新型 DNA 聚合酶热稳定性更高，在有机溶剂和离液盐中的构象稳定性也更强，结果就是 PCR 产物的纯化变得更加困难。真是让人抓狂！割胶回收的烦恼 ✂️ 接下来是割胶回收。这个步骤在技术上要求高，还很难自动化。DNA 暴露在紫外光下会大大降低转化效率，而凝胶纯化的产量往往有限。为了产生最后的终产物，研究人员需要消化毫克级的 DNA。残留的琼脂糖或凝胶提取过程中引入的各种溶剂和盐，可能抑制后续 T4 连接酶的活性，从而降低克隆效率。另外，回收效率还跟片段的长短有关。小于 500bp 或者大于 4kb 的片段，加异丙醇有助于提高回收效率。真是细节决定成败！限制性内切酶的挑战 ⚙️ 限制性内切酶的出现是为了保护细菌免受噬菌体及其他入侵者。因此，限制性内切酶/DNA底物的 KM 值相当低。所以“提高酶切反应中 DNA 的浓度，这样凝胶纯化的产物才足够连接反应使用”是错误的！在这种情况下，限制性内切酶会受到抑制，从而导致不完全的消化。真是让人头疼！ T4 连接酶的脆弱性 𐟔— 连接反应失败的原因有很多，但失败可能在加入 T4 DNA 连接酶之前就发生了：由于 DNA聚合酶扩增不完全导致的末端不均一、酶切不完全、连接酶抑制剂或者突出的部分被补平。在某些情况下，连接反应失败可能是因为退火效率不够、反应缓冲液中的 ATP 浓度过低（室温孵育时间过长）或者酶可能变性了。T4 连接酶在室温下相当稳定，但如果被水而不是合适的 buffer 稀释后可不是如此。如果有问题，可以通过阳性对照来检测酶的完整性。感受态细胞的转化 𐟧ꊊ在克隆过程中，具有高效转化效率的感受态细胞至关重要，这对于之前并不高的分子克隆效率具有一定的补偿作用。最常见的两种转化方法：热激转化和电穿孔。各有利弊，选对了方法能省不少事儿。总之，基因克隆的过程虽然复杂，但只要掌握了这些小技巧，还是能顺利搞定的。希望大家都能顺利完成自己的实验！𐟒ꀀ

质粒构建心得：从零开始到成功质粒，这个实验室的小明星，真的是我们实验的得力助手。它不仅能自己复制，还能轻松扩增，简直是科研人员的最爱。但有时候，一个质粒可不能满足我们的需求，这时候就需要通过一些技巧来构建新的质粒。今天，我就来分享一下我常用的质粒构建方法，希望能帮到大家。选择合适的酶切位点 𐟔ꊩ斥…ˆ，酶切位点的选择至关重要。你可以从文献、载体说明书或者导师的建议中找到合适的酶切位点。一般来说，1的内切酶就足够了。酶切前，记得先加ddH2O，最后再加内切酶。琼脂糖凝胶电泳鉴定 𐟓Š 酶切完成后，我们需要通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定酶切效果。配胶时，要注意选择合适的胶浓度，分子量越大，胶浓度越小。跑胶后，在紫外灯下观察，如果有两段DNA，那就说明成功了：一段是载体，另一段是你需要的片段。接着进行胶回收，注意不要回收切下来的片段。连接反应 𐟔— 插入片段可以通过PCR获得，或者从第三方公司合成。在连接前，也需要用同样的两个内切酶切出缺口。常见的连接体系如下：加入载体和插入片段的量要根据说明书来，先加ddH2O，最后加连接酶。由于连接体系较小，一般使用PCR管进行。连接酶的选择 𐟧ꊧᮤ🝨🞦Ž姚„顺利进行，务必使用配套的连接酶和缓冲液，即使用同一厂家的产品，不能混用。酶和连接酶的保存 ❄️ 这些酶都比较昂贵，使用时要用冰盒，用完及时放回-20℃冰箱。转化感受肽细胞 𐟐Œ 根据载体说明书选择合适的感受肽细胞，同时仔细阅读感受肽细胞说明书，看清涂板体积、涂板后的培养时间、培养温度等。挑取单克隆 𐟧슦Ž訍至少选择两个及以上的单克隆进行摇菌。摇菌与质粒提取 𐟌€ 摇菌时，注意拧松菌管的盖子，倾斜放入恒温（一般为37℃）摇床，摇菌时间12-16小时为宜。摇菌完成后进行质粒提取，测浓度后送测序。这里有一些说明书推荐用新的内切酶酶切后跑琼脂糖胶进行鉴定，这也是一种方法，但最终确定还是推荐进行测序。希望这些小技巧能帮你在质粒构建的道路上走得更顺畅！如果你有任何问题或经验分享，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

三分钟搞懂T4法构建载体的三种变式连接今天我们来聊聊T4法在构建载体时的三种变式连接。T4法常用于空载体的改造，通过两种内切酶将质粒DNA切开，产生带有黏性末端的线性化载体。目的片段通常是合成的小片段DNA分子，长度通常在100bp以下。首先，我们来说说环PCR。环PCR的点突变一般只能引入60bp以下的序列。具体来说，60bp中，20bp作为扩增序列，40bp是额外添加的5’端附加序列，其中需要包含一段同源臂，真正能引入的大概只有40-45bp的额外序列。很少看到有人把PCR使用的引物设计到60bp以上。接下来是无缝克隆。无缝克隆在载体骨架上引入100bp左右的小片段更是一种灾难。无缝克隆酶主要包含三种核心功能酶：5’端核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。其中5’端核酸外切酶的功能远比大家想象的更加强大。虽然我们讲同源臂加20bp左右的序列，但其实5’端核酸外切酶远不止切割掉这20bp左右的同源臂，个人认为切割长度起码在60bp以上。左右各切60bp的话，我们合成的100bp的DNA分子其实已经被切碎了，自然不可能连接到载体上。所以，我们只能通过T4法将80-150bp的短小DNA序列插入载体骨架。具体设计方式如上图所示。下一期，我们将探讨一种被称为“玄学”的技术——搭桥PCR或重叠PCR。这是我以前做分子克隆时第一个感觉玄学的实验，当然到现在我自认为已经非常精通其原理，但仍感觉其相当玄学。关注我，我们一起领略科研背后的底层逻辑！

我想用DNA连接酶，将我缝进你的心里。我有三道防线，也不能将你免疫。晚安～

𐟔즞„建质粒载体的详细指南𐟧슰ŸŒˆ质粒载体的选择：首先，选择一个具备合适限制性酶切位点的质粒载体，这些位点将用于将插入片段整合到多克隆位点中。确保插入片段中不存在这些酶切位点，以避免片段被切开。 𐟌ˆ获取插入片段：DNA可以通过提取任何细胞或组织样品获得，或者通过PCR扩增。 𐟌ˆ酶切反应：扩增完成后，使用限制性内切酶对片段和载体进行酶切。 𐟌ˆ纯化质粒和片段：酶切后，通过电泳分离片段和载体，并使用凝胶纯化回收它们。 𐟌ˆ连接DNA片段：使用DNA连接酶将插入片段连接到质粒中。连接反应中，插入片段与载体的最佳比例为3:1，以确保少量载体自连。连接反应可以在14-25℃下孵育1小时或过夜。 𐟌ˆ转化细菌：通过热激法将连接后的质粒转化到细菌中，并将转化后的细菌涂抹在含有抗生素的琼脂板上，在37℃环境中培养过夜。由于质粒包含抗生素抗性基因，成功转化的细菌在抗生素存在下会生长形成菌落。 𐟌ˆ筛选克隆：从转化板中挑选多个单克隆，接种到含有培养基且已编号的管中，在摇床培养箱中进行扩增，并纯化质粒。 𐟌ˆ鉴定质粒：使用限制性酶切割质粒，并将酶切产物进行凝胶电泳，以检查插入片段的存在。证实转化了插入片段的质粒可用于扩大培养和测序。 𐟑颀𐟔쥜覕𔤸꨿‡程中，每个步骤都需要严格控制条件和操作规范，否则可能导致失败。只要按照这个流程认真操作，相信大家都能成功构建质粒载体！

质粒克隆：无缝克隆与T4法的关键区别在分子生物学中，质粒克隆是构建基因工程载体的重要步骤。𐟔찟笠无缝克隆法和T4法是两种常见的质粒克隆技术，它们各有千秋，适用于不同的实验需求。无缝克隆法，也称为同源重组法，利用同源重组酶来实现质粒与目的片段的连接。𐟔„ 这种方法的原理在于，线性化载体与目的片段通过20bp左右的同源臂进行互补配对，然后利用DNA聚合酶补齐碱基，最后通过DNA连接酶连接上两个切口。无缝克隆法的关键在于其产生的超长3’突出末端，这20bp的同源臂可以视为一个长黏性末端进行互补配对。相比之下，T4法使用相同的限制性内切酶双酶切载体和目的片段，产生相同的黏性末端，然后使用T4连接酶进行连接。𐟔— T4法产生的黏性末端一般仅有2-4bp，这使得它在连接小片段时更为高效。无缝克隆法和T4法的主要区别体现在以下几个方面：连接目的片段的能力：无缝克隆法的20bp同源臂能够固定更长的目的片段进行连接，适合连接超过1000bp的目的片段。而T4法更适合连接短片段，通常不超过2000bp。容错率：无缝克隆法的超长末端虽然提高了连接的稳定性，但也增加了非正常配对的可能性。当同源臂或其两侧出现可以自身互相碱基配对的序列时，连接反应可能会受阻。这种情况虽然是小概率事件，但偶尔会导致连接失败。T4法则由于黏性末端较短，难以发生错误的配对。操作简便性：T4法操作相对简单，适合初学者。无缝克隆法则需要一定的实验技巧和经验，以确保实验的成功。在选择无缝克隆法还是T4法时，应根据实验目的和条件来决定。对于需要连接长片段或对容错率有严格要求的研究，无缝克隆法可能更为合适。而对于短片段的连接或需要快速得到结果的实验，T4法则是一个更便捷的选择。𐟏…𐟔쀀

英文名称：Pomalidomide-PEG4-COOH，Pomalidomide-PEG4-CO2H，POMALIDOMIDE-PEG4-CO2H 中文名称：泊马度胺四聚乙二醇羧酸，泊马度胺-PEG4-羧酸，泊马度胺-四聚乙二醇-羧酸，泊马度胺-四聚乙二醇-酸 CAS：2138440-81-8 分子式：C24H31N3O10 分子量：521.5 Boiling point：773.6ⱶ0.0 Ⰳ(Predicted) density：1.385Ɒ.06 g/cm3(Predicted) storage temp：2-8Ⰳ pka 4.28Ɒ.10(Predicted) 外观性状：浅黄色至黄色黏稠液体 Reaction characteristics： Pomalidomide-PEG4-COOH的结构包含基于Pomalidomide的cereblon配体和用于PROTAC技术的4单元PEG连接物。连接子带有末端羧酸，这一结构特点使得Pomalidomide-PEG4-COOH能够与特定的目标蛋白质配体有效结合。作为E3连接酶配体连接物共轭物，Pomalidomide-PEG4-COOH在PROTAC技术中发挥着桥梁作用，促进目标蛋白质的降解。陕西新研博美生物科技

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